Trizol總RNA提取試劑
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一、 試劑盒說明
上海勁馬-TRIzol 是一種快捷方便的總 RNA 提取試劑，可以從動物組織、各種微生物及細胞等中提取總 RNA。在樣品處
理過程中，TRIzol 可*充分裂解樣品，同時保持 RNA 的完整性。加入氯-仿離心后，溶液形成上清層（水相）、中間層
和有機相（下層）。取出上清層，可用異丙醇沉淀回收 RNA；中間層用乙醇沉淀回收 DNA；有機相可用異丙醇沉淀回收
蛋白。
 上海勁馬TRIzol 試劑可用于少量樣品的 RNA 提取，也可用于大量樣品的 RNA 提取。提取 RNA 整個過程方便快速，整
個操作過程可一個小時內(nèi)完成，提取的 RNA 無蛋白和 DNA 的污染，純度髙，可直接用于 Northern Blotting、斑點雜交、
polyA 篩選、mRNA 純化、體外翻譯、RNase 保護分析、RT-PCR、構建 cDNA 文庫等各種分子生物學實驗。
二、 試劑盒組份

TRIzol 試劑 20 mL 50 mL 100 mL
三、 操作步驟
RNA 提取過程的關鍵是建立一個無 RNase 的實驗環(huán)境，因此在整個操作過程中要防止 RNase 的污染，應注意
以下幾點：
1. 實驗過程中經(jīng)常更換新手套，使用超凈臺，在操作過程中避免講話；
2. 應盡量使用無 RNase 的實驗器材；槍頭、塑料制品和玻璃制品可以用 0.1％DEPC水溶液在 37℃
處理過夜，然后在 120℃下高壓滅菌 30min 以去除殘留的 DEPC。玻璃制品也可用干熱滅菌去除 RNase（180℃
烘烤 2h）；
3. 配制溶液應使用無 RNase 水（無 RNase 水的配制方法：雙蒸水加入 DEPC 至終濃度 0.01％ V/V，放置過夜，然
后 120℃下高壓滅菌 30min，備用）；
4. 整個實驗過程中使用的試劑，實驗器材和無 RNase 水應，避免交叉污染。
用戶自備試劑：氯-仿、異丙醇、75％乙醇（用 DEPC 處理過的水配制）、無 RNase 的無菌水。
1． 樣品處理
A 貼壁培養(yǎng)細胞
1 倒凈培養(yǎng)液；
2 每 10cm2生長的培養(yǎng)細胞中加入 1mL 凱基 TRIzol 試劑，在室溫下水平放置 5min，使裂解液均勻分布于細胞表
面，然后用移液槍吹打細胞使細胞脫落；
3 將細胞裂解液轉移至離心管中，并用 1mL 槍頭反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀，在室溫下放置 5min，使得
核酸蛋白復合物*分離；
B 懸浮培養(yǎng)細胞
1 直接離心收集細胞，倒凈培養(yǎng)液；
2 細胞沉淀中每 5～10×10
6細胞加入 1mL 凱基 TRIzol 試劑；
3 將細胞裂解液轉移至離心管中，并用 1ml 槍頭反復吹打直至裂解液中無明顯沉淀，在室溫下放 置 5min，使
得核酸蛋白復合物*分離；C 動、植物組織材料
1 將組織在液氮中磨碎成粉末狀（應無明顯顆粒）；
2 每 50～100mg 的組織加 1mL 上海勁馬 TRIzol 試劑，樣品的體積不應超過 TRIzol 試劑體積的 10％，并用勻漿器進
行勻漿，直至勻漿液呈無顆粒透明狀；
3 將細胞裂解液轉移至離心管中，在室溫下放置 5min，使得核酸蛋白復合物*分離；
4 12,000g， 4℃離心 10min，然后小心吸取上清液，移入新的離心管中；
2． 向上述步驟 1 得到的裂解液中加入氯-仿（每使用 1mL 上海勁馬 TRIzol 加 0.2mL 氯-仿），蓋緊離心管管蓋，用手上下振蕩
15s（請勿渦漩激烈振蕩），得桔紅色渾濁液，無分層現(xiàn)象，室溫靜置 3min；
3． 12,000g，4℃離心 15min；
4． 取出離心管，樣品分為三層：黃色的上清水相、中間的白色層及粉紅色的下層有機相。小心吸取黃色上清水相移至
另一離心管，水相的體積約為所用上海勁馬 TRIzol 試劑的 60％；
5． 向步驟 4 得到的上清水相加入等體積的異丙醇，輕輕混勻，室溫靜置 10min；
6． 12,000g，4℃離心 10min；
7． 小心去除上清，緩慢沿管壁加入 1mL75％的乙醇（用 DEPC 處理過的水配制），輕輕混勻。每使用 1mL 上海勁馬 TRIzol
試劑至少加 1mL 75％的乙醇；
8． 12,000g，4℃離心 10min；
9． 小心吸盡上清；
10．室溫干燥沉淀 2～5min（不可晾得太干，否則 RNA 將會很難溶解），加入 30～50μL 的無 RNase 水溶解 RNA 沉淀，
待*溶解后于-70℃保存。取 RNA 樣品用 1×TE Buffer（見備注）稀釋樣品 100 倍或適當?shù)谋稊?shù)，測定樣品在 260nm
和 280 nm 的吸收值確定 RNA 的質(zhì)量。
RNA 的濃度＝OD260×稀釋倍數(shù)×0.04μg/μL，OD260/280 在 1.8～2.1 視為抽提的 RNA 的純度很高。
四、 注意事項
本試劑含強變性劑，應避免與皮膚接觸，如接觸皮膚，應立即用大量的水沖洗，根據(jù)需要情況到醫(yī)院處理。本
品含有酚類、巰基-乙醇等成分，具有特殊氣味，請于吸取試劑溶液后馬上蓋好瓶蓋，或于通風櫥中操作。
五、 常見問題分析以及解決方案
1. 一般情況下每毫克的組織或 1×10
6個細胞中所能提取的 RNA 量見下表：
組織材料 TotalRNA 提取量
上皮細胞 約 10μg
成纖維細胞 約 6μg
肝臟 約 5μg
腎臟 約 3μg
肌肉或腦 約 1.5μg
2. 常見問題以及解決方案
常見問題 可能原因 建議解決方案
產(chǎn)率低
含有裂解液的樣品經(jīng)勻漿混勻后未在
室溫靜置，或靜置的時間不足 5 分鐘
嚴格按照說明書操作
RNA 不*溶解 縮短晾干時間
三相分離時，吸取上清液不* 盡量回收上清液
A260/A280＜1.65
測定 OD 值時用的是水溶液 更換測定 OD 值時的溶液，用 TE
Buffer
TRIzol 加量太少，造成蛋白質(zhì)變性不
充分
嚴格按照說明書操作含有裂解液的樣品經(jīng)勻漿混勻后未在
室溫靜置，或靜置的時間不足 5 分鐘
嚴格按照說明書操作
RNA 不*溶解 縮短晾干時間
三相分離后，吸取上清液時不小心接
觸蛋白層造成污染
小心吸取上清
RNA 降解
使用的組織材料不夠新鮮 提取 RNA 的組織材料應采用新鮮
的組織材料，或將新鮮的組織材料
用液氮迅速冷凍后置于-80℃保存
細胞用胰酶消化 不要用胰酶消化細胞
提取 RNA 時使用的試劑及器材中有
RNase 污染
做好試驗前的準備工作，保證無
RNase 污染
提取的組織材料中含有大量的 RNase 加大 TRIzol 的用量
DNA 污染
裂解組織或細胞使用的 TRIzol 量偏少 加大 TRIzol 的用量
使用的組織材料中含有大量的有機溶
劑（如：乙醇、異丙醇等)、高濃度的
Buffer、堿性溶劑等
用 DEPC 水充分洗滌組織
多糖的污染
多糖的理化學性質(zhì)與 RNA 十分接近，
因此很難將其從 RNA 中除去
加大 TRIzol 的用量