一、如何搭配流式抗體熒光標(biāo)記？

    流式抗體熒光標(biāo)記搭配主要由3個(gè)因素決定的：流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道、需要同時(shí)檢測檢測多少個(gè)指標(biāo)、廠家的抗體有多少種熒光標(biāo)記。如果流式細(xì)胞儀的通道越多，那么同一份樣本能同時(shí)做的表面/胞內(nèi)標(biāo)志就越多.

A、 如何根據(jù)流式細(xì)胞儀搭配流式抗體

流式細(xì)胞儀能檢測多少個(gè)通道是由有多少根激光決定的以及每根激光的功能決定的，所以首先需要注意兩點(diǎn)：

流式細(xì)胞儀有哪些激光。

不同型號(hào)的流式細(xì)胞儀的同樣的一個(gè)通道檢測熒光素的能力是不一樣的.

B、搭配熒光素原則

搭配流式熒光素有2個(gè)原則：每個(gè)通道只能選擇1種熒光素；各個(gè)通道之間的熒光素可以隨意搭配，但需注意的是，APC和PE-Cy5一起使用的話，上流式以后，容易導(dǎo)致補(bǔ)償過度。

C、如果檢測的指標(biāo)數(shù)目超過了流式細(xì)胞儀的通道，怎么辦？ 
如果需要做5個(gè)指標(biāo)，而流式細(xì)胞儀只能做4個(gè)通道，首先將指標(biāo)歸成2類，再將樣本分成2份，分別檢測。比如需要同時(shí)檢測CD3、CD4、CD8、IL-4和IFN-gamma，那么將樣本分成兩份，第1份加CD3、CD4、CD8和IL-4，而第2份加CD3、CD4、CD8和IFN-gamma。

二、同型對(duì)照（Isotypy Control）

1、為什么要用同型對(duì)照？ 
同型對(duì)照是使用與一抗相同種屬來源、相同亞型、相同劑量和相同的免疫球蛋白及亞型的免疫球蛋白，用于消除由于抗體非特異性與細(xì)胞結(jié)合而產(chǎn)生的背景染色。同型對(duì)照是真正意思上的陰性對(duì)照，它不但可以用來設(shè)定流式細(xì)胞儀的電壓，而且還可以幫忙省去昂貴與繁瑣的重組細(xì)胞因子競爭封閉步驟。在流式細(xì)胞儀上樣前，染色方式如下： 
樣本管：一抗＋樣本 
同型對(duì)照管：同型對(duì)照＋樣本

2、如何選擇同型對(duì)照？ 
一般選擇與一抗的成分*相同種屬來源、相同亞型和亞鏈、相同熒光標(biāo)記的抗體，比如抗人的CD56 APC標(biāo)記的抗體，貨號(hào)是555518,成份是Mouse IgG1,κ。那么它的同型對(duì)照應(yīng)該是APC標(biāo)記的Mouse IgG1,κ，貨號(hào)是555751。注意同型對(duì)照的成份跟它的名稱是相同的.如果是抗體的組合形式是純化的一抗＋熒光標(biāo)記的二抗，那么應(yīng)該選擇一抗的同型對(duì)照。比如CDw125的純化抗體，貨號(hào)是555901，成分是Mouse IgG1,κ。它的同型對(duì)照是純化的Mouse IgG1,κ，貨號(hào)是555746。它的二抗PE標(biāo)記的抗小鼠IgG1,貨號(hào)是550083。那么染色方式如下： 
樣本管：純化的CDw25＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1 ＋樣本 
同型對(duì)照管：純化的同型對(duì)照＋PE標(biāo)記的抗Mouse IgG1＋樣本

如果沒有找到適合的同型對(duì)照，在保持來源相同、熒光標(biāo)記相同、免疫球蛋白類別相同條件下，那么優(yōu)先選擇的順序應(yīng)該是亞鏈不同--亞型不同--相同類 
別。比如，某種的抗體的來源是Mouse IgG2а,κ。如果在同型對(duì)照表里面找到不到*相同的同型對(duì)照，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2а為同型對(duì)照。如果也沒有找到Mouse IgG2а，那么優(yōu)先選擇相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2b作為同型對(duì)照。如果zui后還是沒有找到Mouse IgG2b，那么選者相同熒光標(biāo)記的Mouse IgG2作為同型對(duì)照。

3、哪些人需要使用同型對(duì)照？ 
A 對(duì)流式不是非常熟悉的人。 
B 做胞內(nèi)流式人，比如胞內(nèi)細(xì)胞因子、趨化因子和信號(hào)蛋白等。 
C 使用不常見的標(biāo)志或者特異性不高的標(biāo)志的人，因?yàn)閷?shí)驗(yàn)者不熟悉不常見標(biāo)志的表達(dá)情況，根據(jù)同型對(duì)照可以判斷陽性細(xì)胞的位置。一些特異性不高的抗體，如多抗，非特異性結(jié)合非常多，使用同型對(duì)照可排除假陽性。 
D 對(duì)流式非常熟悉又使用常用的表面標(biāo)志的人一般可以不使用同型對(duì)照。

4、為什么有時(shí)候同型對(duì)照的表達(dá)會(huì)比抗體的表達(dá)高？ 
首先需要檢查同型對(duì)照的抗體是否加錯(cuò)類型、劑量等。其次，因?yàn)橛行?biāo)志在細(xì)胞的表面或者胞內(nèi)表達(dá)不高，而跟其類似的抗原非常多，那么加入同型對(duì)照時(shí)，
同型對(duì)照非特異性的結(jié)合會(huì)超過抗體的特異性，所以會(huì)造成這種現(xiàn)象，在細(xì)胞表面時(shí)如圖所示。這個(gè)時(shí)候推薦使用其他陰性對(duì)照，如空白對(duì)照等。